ELISA 作為經(jīng)典的免疫檢測(cè)方法，看起來(lái)很平常，然而真正做好它并不容易。有哪些秘笈，讓上海仁捷生物 的 ELISA 專家告訴你：

1. 確定您的樣本類型和試劑盒可以兼容

常見樣本類型有血清，血漿，細(xì)胞培養(yǎng)上清，如果是廠家實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)的，可根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明購(gòu)買使用?！咀⒁猓貉獫{制備用到的抗凝劑有 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等多種，相應(yīng)的血漿性質(zhì)存在差異，需單獨(dú)確認(rèn)兼容性】。

特殊樣本，如尿液、胸腹水、腦脊液、灌洗液、淚液，組織勻漿液等，可能缺乏廠家數(shù)據(jù)支持，這并不是說(shuō)試劑盒無(wú)法應(yīng)用于這些樣本，而是需要咨詢有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)人士或自行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可行性（如需進(jìn)行摻入回收實(shí)驗(yàn)）。

2. 試劑盒檢測(cè)范圍需要匹配樣本中標(biāo)志物濃度

ELISA 試劑盒的定量檢測(cè)范圍需參考標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線zui低和zui高濃度區(qū)間內(nèi)屬于線性范圍，其中的值是可信和可定量的。濃度高于線性范圍的樣品要稀釋到線性范圍內(nèi)來(lái)測(cè)量，而濃度低于線性范圍的樣品，其測(cè)量值不能用于計(jì)算濃度，只能用做參考。有一種常見的相關(guān)情況是：健康人樣本中很多標(biāo)志物的濃度偏低，測(cè)量值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線zui低值。

3. 樣本收集有講究

以血清為例，樣本收集可參考試劑盒說(shuō)明書，但需注意以下要點(diǎn)。樣本盡量用無(wú)菌管收集，避免細(xì)菌的酶類和代謝產(chǎn)品對(duì)結(jié)果的影響。采集過(guò)程要避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞溶解釋放的活性物質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)。保存過(guò)程中如有沉淀，應(yīng)離心后取上清液。樣本若不立即測(cè)定，建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃，每次檢測(cè)使用一管，即避免交叉污染和反復(fù)凍融，有能保證檢測(cè)結(jié)果的平行可比性。

4. 實(shí)驗(yàn)前要準(zhǔn)備好相應(yīng)試劑

提前將所有試劑平衡到室溫環(huán)境，這個(gè)過(guò)程大致需半小時(shí)左右。洗液是濃縮液，如有結(jié)晶析出，需*溶解后再進(jìn)行稀釋。A、B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液。為保證蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制質(zhì)量，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉，重溶前需將管子離心，加入說(shuō)明書的緩沖液，慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻，至少 15 分鐘，不建議用槍頭吹打。溶解后如需保存，按每次使用量分裝后根據(jù)說(shuō)明書要求的溫度保存。梯度稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，建議用聚丙烯管（對(duì)蛋白吸附力很低），每步都要充分混勻且更換新槍頭，確保梯度準(zhǔn)確性。

5. 儀器設(shè)備的準(zhǔn)備也*

相關(guān)設(shè)備包括移液器、洗板機(jī)/搖床和酶標(biāo)儀。移液器的準(zhǔn)確性對(duì)于ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性十分關(guān)鍵，需要確保定期校準(zhǔn)維護(hù)。搖床的使用是為了讓反應(yīng)體系快速達(dá)到平衡，獲得穩(wěn)定、可重復(fù)的結(jié)果。不用搖床對(duì)實(shí)驗(yàn)通常的影響是，OD 值低，CV 大。酶標(biāo)儀等設(shè)備使用前提前 15 分鐘開機(jī)預(yù)熱。

6. 預(yù)實(shí)驗(yàn)：通常預(yù)實(shí)驗(yàn)包括全部標(biāo)準(zhǔn)曲線和小量樣本。

預(yù)實(shí)驗(yàn)有兩個(gè)主要目的，一來(lái)是熟悉實(shí)驗(yàn)流程，發(fā)現(xiàn)可能忽略的問(wèn)題；二來(lái)是測(cè)試樣本和試劑盒是否匹配，一旦出現(xiàn)不匹配的情況，不至于浪費(fèi)過(guò)多樣本。另外是對(duì)樣品中目的分析物的豐度作一下大致了解，以確定合適稀釋度。

7. 剩余的試劑盒材料要妥善保存

標(biāo)準(zhǔn)品分裝后按說(shuō)明書要求的溫度保存，這樣可以避免污染，對(duì)要求冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)品還可以避免反復(fù)凍融；酶標(biāo)板放回錫箔紙袋，加入干燥劑，封緊封口，4℃保存。忌未將酶標(biāo)板*平衡至室溫，就放回錫箔紙袋，因?yàn)榇藭r(shí)由于溫度差，酶標(biāo)板上會(huì)有水汽，不利于穩(wěn)定保存。

8. 加樣要快速準(zhǔn)確，避免氣泡

加樣時(shí)間宜控制在 15 分鐘內(nèi)。加樣前要將樣本混勻，特別是凍存后融化的樣本（自然融化的血清等樣本會(huì)有分層現(xiàn)象），應(yīng)上下顛倒充分混勻，注意動(dòng)作輕緩，避免產(chǎn)生氣泡。如凍存融化后的樣本有沉淀，可以再次離心。整個(gè)加樣過(guò)程都要注意避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)影響蛋白的相互結(jié)合，而影響反應(yīng)進(jìn)行。

9. 孵育時(shí)要保證溫度均勻，防止揮發(fā)變干

孵育時(shí)壓緊封口膜。多塊板一起實(shí)驗(yàn)時(shí)，要平放各板，不要疊放，以免因溫度不均造成漂移或邊緣效應(yīng)。

10. 洗板機(jī)的應(yīng)用

使用洗板機(jī)，不但可以降低勞動(dòng)強(qiáng)度，而且有利于保證 ELISA 測(cè)試的穩(wěn)定性。目前的全自動(dòng)洗板機(jī)不但具有很多實(shí)用的洗滌動(dòng)作，如底部沖洗，兩點(diǎn)吸液，震動(dòng)，交叉吸液；還可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)沖洗壓力，沖洗距離，沖洗時(shí)間等參數(shù)。通過(guò)優(yōu)選這些動(dòng)作和參數(shù)，能保證良好的洗滌效果。洗板機(jī)的性能對(duì)于結(jié)果準(zhǔn)確性影響也很大，好的洗板機(jī)要保證洗板后的殘留液盡可能的少，一般不超過(guò) 2μL，以洗滌后用人工拍板墊紙不濕為準(zhǔn)。應(yīng)定期檢查抽吸針頭是否堵塞。洗液如果含有吐溫，應(yīng)隨用隨配。

11. 手動(dòng)洗板的操作指南

加洗液要快速，沒(méi)有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應(yīng)新鮮配制，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無(wú)粉塵和碎屑的吸水紙。需要用力拍板，使孔內(nèi)沒(méi)有可見液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標(biāo)板拍干后立即做后續(xù)的加液。

12. 顯色反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)

ELISA 實(shí)驗(yàn)是個(gè)酶促底物顯色反應(yīng)，隨時(shí)間增加，顯色變深，所以選擇*時(shí)間終止反應(yīng)是得到準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本濃度的重要因素。終止過(guò)程要*。使用的 TMB 底物時(shí)*終止點(diǎn)是黃色，不會(huì)有任何程度的藍(lán)色或綠色，終止過(guò)程中必要時(shí)可以震蕩 96 孔板，或用槍頭抽吸混勻（終止液含強(qiáng)酸，避免腐蝕）。

13. 數(shù)據(jù)分析

按照說(shuō)明書推薦的數(shù)據(jù)分析方法做曲線擬合及分析。說(shuō)明書中的標(biāo)準(zhǔn)曲線是在廠商的實(shí)驗(yàn)室中，由非常有經(jīng)驗(yàn)的操作人員得到的結(jié)果?？蛻舻臉?biāo)準(zhǔn)曲線和說(shuō)明書中的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能存在不同，但不等于不好。通常判斷標(biāo)準(zhǔn)曲線合格的標(biāo)準(zhǔn)為：背景OD 值 <0.2；zui高點(diǎn) OD 值>1.0；相關(guān)系數(shù) R2 接近或等于 1。只要滿足這些條件的標(biāo)準(zhǔn)曲線都是可以使用的。

結(jié)語(yǔ)

當(dāng)您了解并掌握了 ELISA 實(shí)驗(yàn)的這些，離做出zui棒的 ELISA 就只有一步之遙了，接下來(lái)不妨到 上海仁捷生物業(yè)界金標(biāo)準(zhǔn)的 ELISA 試劑盒中挑選一款適合您的產(chǎn)品，去獲得穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)嘍。